创新先锋 | 一代传奇——蔡司双光子超高分辨率显微镜
一代传奇
赌场上想赢,就要拥有一双能够透视的眼睛；
情场上想赢,就要透过外表看穿他/她的心；
科研中的你是否也想拥有超能力，看穿一切？
助力您的科研，让您拥有超能力！
且听蔡司君给您道来这款神器的威力吧！
一切始于一位伟大女科学家的惊人猜想
既然荧光分子可以吸收短波长的单光子，那么是否也可吸收两个连续发射长波长的光子呢？
1931年
一位年轻女科学家Maria Goeppert Mayer提出了这个问题（1963年获得诺贝尔物理学奖）；
1961年
Wolfgang Kaiser等人首次观察到双光子的激发现象；
1990年
Winfried Denk将双光子激发与激光扫描相结合，真正实现了双光子显微镜；对于生物领域的研究尤其是神经生物学的研究有着深远的意义。
神奇的双光子
激光共聚焦显微镜也称之为单光子显微镜，基本原理：一个短波长的光子激发分子跃迁到激发态，分子从激发态回到基态时释放荧光能量——荧光。
双光子显微镜：在长波长（690-1300nm）激发下，分子通过几乎同时（10-18s）吸收两个光子跃迁至激发态，分子从激发态跃迁至基态时释放荧光分子。
但是，要实现双光子的激发需要一个特殊的神器--可调谐锁模钛蓝宝石红外飞秒脉冲激光器。该激光器可发射时间间隔非常短的高密度光子，实现两个光子激发；并且脉冲特性可以减少光毒性，在成像同时还可保持生物活性。
双光子显微镜的诞生解决了活体成像需求，穿透厚样品看到内部的细节，如同我们有了可以透视的双眼，洞悉生物体中的瞬息万变。
快问快答：
Q：活体观察又可以看到什么有趣的现象呢？
我们可以在活体下，探索哪些神经元可以响应决策，哪些神经元响应声音、视觉信息的整合，哪些神经元负责了学习记忆等。不止如此，还可以在活体状态观察血管流动，探索哪些细胞可以负责造血，血液中的细胞在炎症发生时如何响应等。
应用实例-小鼠脑活体成像：
▲小鼠运动区神经元, GCaMP3标记；20x 1.0 W Plan-Apo；Dr. Wake , NIPS, Matsuzaki Lab
新的挑战
但是随着科学技术的发展及科研的深入，双光子显微镜已不能简单的满足科学家的需求，由于双光子的波长较长，其分辨率、图像的对比度相比于单光子较差，图像的采集速度也不能满足高时间分辨率的研究者的需求。
Don’t Worry！ 蔡司懂得您的烦恼，来自蔡司的双光子超高分辨率显微镜便可解决该问题。
▲蔡司的双光子超高分辨率显微镜双光子超高分辨率显微镜
双光子超高分辨率显微镜将双光子技术与Airyscan超高分辨率技术完美结合，实现了双光子的超高分辨率、高信噪比、高采集速度。
▲Airyscan
▲Mutiplex 模式
Airyscan检测器是由32个小的检测单元组成的蜂巢状结构，可实现高分辨高信噪比，同时Airyscan技术的Mutiplex的模式，可大幅度提升采集速度，在512X512像素采集时可达到47.5fps。
1、Airyscan-高分辨率
Airyscan SR采集模式，可以实现120nm的分辨率及最大信噪比优化。
2、Airyscan-高采集速度
Airyscan 可进行多达8倍并行数据处理，同时获得超高分辨、最优化的信噪比、最大采集速度47.5fps（512X512像素）。
3、Airyscan-高信噪比
▲蟋蟀胚胎 @ 900nm Excitation；Airyscan Two Photon Excitation；GFP-Phalloidin；Sample courtesy of S. Donoughe Harvard University
▲GaAsP NDD ▲Airyscan
从图中可以看到Airyscan 可以实现更高的分辨率、更高的信噪比，捕捉更多样品细节。
应用实例——斑马鱼钙离子：
双光子超高分辨率显微镜可以实现双光子高分辨率高信噪比高采集速度，更加真实还原生物体的响应。
▲斑马鱼 GCaMP5标记 @ 920 nm Excitation，可以看到随着时间钙信号的快速变化；40X 1.0 W Plan Apochromat；Sample Courtesy of Drew Friedmann, University of California Berkeley
扩展应用
双光子超高分辨率显微镜可不光能看到活体钙离子的变化，不然怎能配得上一代传奇称号呢？
1、透明化样品成像
双光子超高分辨率显微镜还可对透明化的组织进行成像。
▲YFP标记透明化小鼠脑 @ 920 nm Excitation，成像深度达到5.6mm。20x Scale lens；Sample and data set: Hiroshi Hama, Fumiyoshi Ishidate, Atsushi Miyawaki, RIKEN BSI, Wako, Japan
2、二次/三次谐波成像
▲小鼠提睾肌；绿色：横纹肌二次谐波信号；红色：神经髓鞘三次谐波信号；S. Dietzel, LMU München, Germany
二次/三次谐波即利用特定波长激发无染色的特殊样品，获得激发光1/2或1/3波长的发射光。
总结
纵观整个显微镜的发展史，无不都是围绕三个大目标前行：高分辨率；活体；高对比度。双光子超高辨率显微镜将双光子与Airyscan超高分辨率技术结合，在提升成像深度，降低光漂白同时，提高图像分辨率、信噪比和成像速度，该系统尤其适合活体深度高分辨率成像。
蔡司君愿给您一双双光子超高分辨率的眼睛，带您寻找科研的乐趣，为您的科研保驾护航。祝愿您早日可成为科学界的一代传奇，为科研事业贡献自己的一份力量。
明辨未来，未来可期。
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（颜润川 蔡司显微镜）
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